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Em nosso blog, já falamos sobre a técnica de pesquisa Western Blotting; especificamente sobre suas aplicações e objetivo.

Para aprofundar ainda mais o tema, hoje explicaremos quais as principais etapas do processo, como são realizadas e qual a função de cada passo.

Se tem dúvidas sobre o assunto, continue a leitura e descubra tudo sobre esse meio de análise biológica!

O que é Western Blotting?

A principal função da transferência Western, com também é chamada, é detectar e quantificar proteínas presentes no componente biológico de estudo.

Desse modo, facilita-se a observação de resultados de uma pesquisa como, por exemplo, o aumento de proteínas de uma amostra específica.

Como já citado, esse procedimento, comum em ambientes de pesquisa, possui etapas a serem seguidas, para que seja realizado com o máximo de eficiência.

Entre essas etapas, podemos citar:

  • Extração e quantificação das proteínas;
  • Fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida;  
  • Transferências dessas proteínas para uma membrana;  
  • Incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína;
  • Detecção da proteína específica.

Devido a importância de realizar o procedimento seguindo todos os passos, para garantir bons resultados, é necessário saber qual a finalidade de cada etapa.

Então, continue a leitura!

Extração e quantificação das proteínas

O primeiro passo quando falamos do experimento Western Blotting, é a extração e quantificação das proteínas.

Isso porque, é o passo inicial para analisar a presença ou não de proteínas de uma amostra e sua quantidade.

O ensaio Bradford, é a maneira mais utilizada para obtenção dos resultados necessários; isso porque, apresenta diversas vantagens em relação a outros disponíveis.

O procedimento é comum, por sua velocidade para a chegada aos resultados. Além disso, não exige aquecimento ou alta sensibilidade, sendo capaz de agir sobre baixas quantidades de proteína na amostra.

O método se baseia na mudança de cor do composto Coomassie Blue G-250, que apresenta cor avermelhada para soluções ácidas, e muda para a cor azul ao entrar em contato com as proteínas da amostra.

Após constatada a existência de proteínas no objeto de análise, é necessário quantificar a sua presença.

Por isso, é utilizada uma curva de padronização, usando concentrações já conhecidas de outra proteína.

Dessa forma, obtemos uma equação linear em que, trocando os valores médios de absorbância das amostras, chegamos aos valores de concentração da proteína.

Fracionamento das proteínas

Agora que já contatamos, como é realizada a extração e quantificação de uma proteína em amostra, é preciso entender como é realizado o fracionamento dessas substâncias e qual a razão do procedimento.

O método de fracionamento mais comum, é a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida.

Nesse processo, as moléculas que possuem cargas positivas e negativas, como as proteínas, são separadas de acordo com a suas características físicas e peso molecular, quando passam por uma corrente elétrica.

Dessa forma, o seu uso se torna comum. Pois, é responsável pela separação, até mesmo, de proteínas insolúveis em água, caso comum em muitas proteínas de membrana, por exemplo.

Além disso, com a separação feita através do tamanho das moléculas, é possível determinar o peso molecular e a composição da proteína.

Outro fator importante, é a possibilidade de visualizar a proteína por meio do uso de corantes ou tratamento com nitrato de prata.

Por isso, a coloração do componente é alterada, o que facilita a percepção da sua presença na amostra analisada.

Nos casos em que o nitrato de prata é usado, é possível identificar a presença de proteínas em baixa concentração, já que é um método mais sensível.

Os corantes específicos também são bem comuns, principalmente, por sua praticidade, como exemplo, podemos citar o Lightwave da GVS, trata-se de um substrato a base de luminol não istópico.

O componente é projetado para quimioluminescentes detecção de proteínas imobilizadas e ácidos nucléicos imobilizados conjugados com peroxidase de rábano.

o-método-mais-comum-para-fracionamento-da-proteína

Transferência para membrana

Após a fragmentação das proteínas presentes em uma solução, é necessário realizar a transferência do material obtido para uma membrana de transferência.

Para isso, existem diversos métodos utilizados como: vácuo, capilaridade e difusão, mas, o processo mais comum nesse tipo de análise é a eletroeluição ou electroblotting.

Com o auxílio de almofadas porosas e papel de filtro, é feita a aplicação de uma carga elétrica, que resulta na saída da proteína do gel de poliacrilamida.

Assim, as proteínas se ligam à superfície da membrana, mantendo o padrão estabelecido no gel de poliacrilamida.

A eficiência do procedimento é dependente de alguns fatores como, por exemplo, a composição do gel, presença de detergentes e álcool no tampão, e a composição das proteínas.

Além disso, o tempo de transferência exerce forte influência nos resultados do processo, assim como, o contato da membrana com o gel, que deve ser completo.

Após a realização do procedimento de transferência, existem alguns processos a serem seguidos para confirmar a passagem das proteínas do gel para a membrana.

Nesse passo, a utilização de corantes que reagem à proteína é muito utilizado para constatar a ausência de proteína no gel de poliacrilamida.

Além do mais, é possível verificar a igualdade entre as amostras resultantes da transferência e, apenas em situações satisfatórias, é dado seguimento ao processo de Western Blotting.

Incubação da membrana

Depois de passar por extração, quantificação, fracionamento e transferência, a proteína já na membrana, passa por um processo de incubação.

Esse procedimento, se obtém por meio da aplicação de uma proteção, para que os anticorpos não se liguem a toda superfície da membrana.

Assim, garantindo a presença deles apenas no antígeno, e bloqueando o restante da membrana.

Normalmente, a utilização de leite em pó desnatado é o mais indicado para esse bloqueio, exceto nos casos em que os componentes do leite podem prejudicar a ligação dos anticorpos aos antígenos.

Nesses casos, é utilizado o PVP (poli-vinil-pilorridona), que é um polímero sintético que não prejudica essa relação.

Após a incubação com a solução inicial, que deve durar cerca de uma hora e estar em temperatura ambiente e constante agitação, é realizada a lavagem da membrana três vezes a cada 5 minutos.

Depois disso, é iniciado o processo de adição de anticorpos a membrana, ou seja, o primeiro componente a se ligar ao antígeno.

Para isso, é realizada a diluição dos anticorpos à solução de bloqueio. Alguns protocolos, padronizam a fração de 1/100 para a realização dessa mistura.

Assim, após a aplicação da diluição na membrana, é feita uma nova incubação, por uma hora e em constante agitação.

O segundo anticorpo obtido, é a molécula de antígeno; esse anticorpo pode conservar a função dos dois componentes, como a atividade enzimática da enzima e antigenicidade do antígeno.

Além disso, ele é classificado como anti-IgG, ou seja, ele pode localizar outros anticorpos com a mesma estrutura.

Existem algumas modificações nesse segundo anticorpo, que permitem a visualização da proteína de interesse, á qual ele é submetido.

Quais as aplicações do método Western Blotting?

Como já mencionamos, alguns passos presentes no procedimento, permitem um resultado mais rápido e com menos requisitos para serem alcançados.

Dessa forma, sua utilização é muito comum em diversos setores que necessitam de análise biológica como, por exemplo, testes que detectam a presença de HIV.

Aliás, o teste Western Blotting é o meio confirmatório de HIV, já que detecta a presença de anticorpos ao vírus.

Mas, não se resume apenas a isso, ele pode ser realizado para diagnósticos de diversas doenças e processos que necessitam de uma dimensão para a presença de proteínas em uma solução, por exemplo.

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http://www.conhecer.org.br/enciclop/2012b/ciencias%20agrarias/western.pdf